Nhu cầu xét nghiệm nhanh SARS-CoV-2 trên thế giới ngày càng tăng
Trong tình hình COVID-19 gây ra bởi virus SARS-CoV-2 đang là đại dịch toàn cầu. Tính đến ngày 24/4/2020, hơn 2,6 triệu ca nhiễm COVID-19, gần 185.000 ca tử vong đã được xác nhận trên toàn thế giới. Với thực trạng nhiều nước trên thế giới chưa bùng phát và chạm ngưỡng đỉnh dịch, số ca nhiễm SARS-CoV-2 được dự đoán có khả năng sẽ còn tăng lên đáng kể, gây nguy hại nghiêm trọng đến nền kinh tế của các quốc gia. Bên cạnh việc chủ quan trong kiểm soát dịch, lây nhiễm cộng đồng được xem là một trong những nguyên nhân chính khiến nhiều quốc gia phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp vì bùng phát số ca nhiễm COVID-19.
COVID-19 đã ảnh hưởng đến cuộc sống của hàng tỷ người trên thế giới.
Trước thực tế đó, lấy mẫu xét nghiệm sàng lọc COVID-19 trong cộng đồng được xem là giải pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả. Hai kỹ thuật chẩn đoán nhanh COVID-19 được áp dụng phổ biến là phát hiện kháng nguyên hoặc phát hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể (kháng thể). Tuy nhiên, phương pháp xét nghiệm huyết thanh học (phát hiện kháng thể) mặc dù có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao (dễ xảy ra dương tính giả), vì vậy được sử dụng nhằm điều tra và cách ly nguồn lây nhiễm, đồng thời giám sát lịch sử huyết thanh học ở khu vực khảo sát. Trong khi đó, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên có độ đặc hiệu cao nhưng mở rộng xét nghiệm nhanh trong cộng đồng còn gặp khó khăn do hạn chế về trang thiết bị, số lượng và độ chính xác của kit xét nghiệm.
Tại Hoa Kỳ, hầu hết các công cụ chẩn đoán (bộ kit) được Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm (FDA) cấp giấy phép sử dụng khẩn cấp (emergency use authorization) đều sử dụng phương pháp RT-qPCR (đầu dò thủy phân - probes base) để phát hiện các gen RNA virus từ mẫu bệnh nhân tách chiết. Tuy nhiên, việc tách chiết RNA thường mất thời gian và chi phí không nhỏ dẫn đến hạn chế số lượng xét nghiệm mỗi ngày. Ngoài ra, nhu cầu sử dụng tăng cao đột ngột cũng gây ra thiếu hụt hóa chất tách chiết RNA. Do đó, với bộ kit có khả năng phát hiện mạnh, trực tiếp từ các mẫu dịch tiết đường hô hấp sẽ đem lại thuận lợi lớn, tiết kiệm thời gian và chi phí xét nghiệm, đáp ứng lượng mẫu ở quy mô lớn.
Để giúp đẩy nhanh các nỗ lực phát triển kit chẩn đoán, các nhà khoa học đã thử nghiệm phát hiện RNA đích của virus SARS-CoV-2 bằng hóa chất RT-qPCR và RT-LAMP hiện màu của Hãng New England Biolabs (NEB, Hoa Kỳ). Bộ kit RT-LAMP hiện màu còn tiếp tục được thử nghiệm để phát hiện RNA virus SARS-CoV-2 tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm. Kết quả cho thấy, đây là phương pháp đơn giản và có độ nhạy cao, cung cấp cơ hội phát hiện virus nhanh và chính xác mà không yêu cầu cơ sở hạ tầng chẩn đoán phức tạp.
Xét nghiệm nhanh COVID-19 bằng RT-qPCR và RT-LAMP
Về mặt nguyên lý, hầu hết các kỹ thuật phát hiện vật liệu di truyền của virus nói chung đều dựa vào khuếch đại gen. Các kỹ thuật này cho phép phát hiện sự có mặt của ARN virus trong mẫu bệnh phẩm. Đối với quy trình phát hiện kháng nguyên của SARS-CoV-2, dụng cụ chuyên dụng (tăm bông - bản chất là cái chổi lông) được đưa vào lấy mẫu ở họng mũi (tỵ hầu) và họng miệng (khẩu hầu). Theo khuyến cáo, để phát hiện SARS-CoV-2, cả hai loại bệnh phẩm này của một bệnh nhân thường được để chung vào một ống có môi trường bảo quản mẫu (UTM). Môi trường này được vận chuyển về phòng xét nghiệm để xử lý và tinh sạch, sau đó phân tích bằng kỹ thuật RT-qPCR để phát hiện sự có mặt của SARS-CoV-2 trong bệnh phẩm. Việc phát hiện RNA của SARS-CoV-2 từ bệnh phẩm có thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kỹ thuật lấy mẫu dịch tiết đường hô hấp, chất lượng của UTM và quy trình tinh sạch RNA tổng số.
Dung sai do UTM là một yếu tố quan trọng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phát hiện SARS-CoV-2. Một số thí nghiệm được tiến hành nhằm đánh giá tác động của UTM đối với các hóa chất dùng để phát hiện RNA virus như: Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR kit (dành cho đầu dò thủy phân phát hiện RNA, một bước), LunaScript® RT SuperMix kit (để tổng hợp cDNA trong quy trình RT-qPCR, hai bước) và WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA và RNA) (sao chép ngược và khuếch đại đẳng nhiệt RNA, hiện màu có thể nhìn thấy được). Kết quả cho thấy, cả hai hóa chất Luna RT-qPCR một bước và hai bước đều có khả năng chịu dung sai UTM cao, không ảnh hưởng đến kết quả phát hiện SARS-CoV-2. Độ nhạy phát hiện và định lượng tuyến tính được ghi nhận cả ở mRNA đích người (actin) và RNA đích của virus SARS-CoV-2 (gen N).
Trong quy trình RT-LAMP hiện màu, sự thay đổi màu được quan sát thấy khi có khuếch đại (màu hồng sang màu vàng). Sự đổi màu này được giải thích do quá trình giảm pH trong dung dịch, là kết quả hoạt động mạnh mẽ của enzyme DNA polymerase trong phản ứng LAMP dương tính. Do đó, các nhà khoa học đã kiểm tra xem liệu đệm bổ sung có trong UTM có ức chế sự đổi màu hay không và liệu màu của UTM (màu hồng) có che mất sự đổi màu của RT-LAMP không. Khả năng đổi màu vẫn được ghi nhận khi tăng thể tích mẫu (5 μl mẫu trên mỗi phản ứng 25 μl), nhưng hạn chế là cần phải có một phương pháp phát hiện thay thế (phát hiện DNA sợi kép dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang).
Để phát hiện trực tiếp SARS-CoV-2 trong các mẫu bệnh phẩm đòi hỏi phải có các hóa chất kháng được sự ức chế của dịch ly giải tế bào và RNA virus được bảo vệ khỏi sự phân hủy của enzyme RNase nội bào trước khi xét nghiệm. Để đánh giá cả hai yếu tố này, thí nghiệm đã ly giải tế bào cùng với RNA tổng hợp SARS-CoV-2 (vRNA), sau đó đánh giá sự phát hiện và định lượng bằng RT-qPCR một bước và RT-LAMP hiện màu (sử dụng vRNA tách chiết làm đối chứng). Quá trình ly giải tế bào được thực hiện bằng Luna Cell Ready Lysis Module, trong đó bao gồm hóa chất bảo vệ RNA để ngăn chặn sự phân hủy RNA. Các nhà khoa học nhận thấy, sử dụng Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit, các vRNA đích của SARS-CoV-2 được phát hiện với độ nhạy cao (cả khi có và không có dịch ly giải tế bào) (hình 1). Khi sử dụng WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix cho RT-LAMP hiện màu, vRNA đích của SARS-CoV-2 cũng được phát hiện với độ nhạy cao (gần 50 bản sao cho mỗi phản ứng). Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng lưu ý rằng cần phải pha loãng dịch ly giải tế bào theo tỷ lệ 1:10 để phát hiện sự đổi màu, vì dung dịch đệm ly giải tế bào sẽ ngăn ngừa sự thay đổi pH ở nồng độ cao (hình 2).
Hình 1. Phát hiện và định lượng trực tiếp các mục tiêu RNA virus SARS-CoV-2 có mặt trong dịch ly giải tế bào với bộ hóa chất One-Step RT-qPCR. RT-qPCR định lượng đa mồi gen N (A) và Orf1a (B) của virus SARS-CoV-2 từ mẫu chỉ có RNA virus tổng hợp (đường màu sáng) và dịch ly giải tế bào người (Hela) có chứa RNA virus tổng hợp (đường màu tối). Ly giải tế bào được thực hiện sử dụng bộ hóa chất Luna Cell Ready Lysis Module, và các mục tiêu RNA được định lượng với bộ hóa chất Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit. Đối với RNA virus tổng hợp, lượng mẫu đầu vào trong khoảng 50-500.000 bản sao cho mỗi phản ứng. Mẫu dịch ly giải tế bào có RNA virus tổng hợp được pha loãng tương đương 0,2 đến 20.000 tế bào mỗi phản ứng.
Hình 2. Phát hiện trực tiếp các mục tiêu RNA SARS-CoV-2 từ dịch ly giải tế bào bằng kỹ thuật RT-LAMP. Bộ hóa chất WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix được sử dụng để phát hiện các mục tiêu RNA SARS-CoV-2 có mặt trong dịch ly giải tế bào. Các tế bào người (Hela) được ly giải khi có sự hiện diện của RNA virus tổng hợp sử dụng bộ hóa chất Luna Cell Ready Lysis Module. Các mẫu dịch ly giải sau đó được pha loãng tỉ lệ 1:10 và 1 μl sẽ được thêm vào cho mỗi phản ứng RT-LAMP hiện màu đã cho ra 48-4.800 bản sao RNA virus tương đương với 2-200 tế bào mỗi phản ứng.
Thay lời kết
Khi các phác đồ điều trị còn chưa thực sự hiệu quả, vắc xin chưa sẵn sàng, các kỹ thuật xét nghiệm nhanh là một công cụ đặc biệt quan trọng giúp kiểm soát sự lây lan của đại dịch COVID-19 trong cộng đồng. Ở thời điểm hiện tại, RT-qPCR là công cụ tối ưu nhất hiện nay trong xét nghiệm chẩn đoán COVID-19, còn RT-LAMP hiện màu có nhiều lợi thế quan trọng. Vì RT-LAMP hiện màu sử dụng kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt và đánh giá kết quả trực quan thông qua sự thay đổi màu nên nhận biết kết quả đơn giản, nhanh chóng (có kết quả trong vòng 30 phút ủ mẫu), cho phép sử dụng rộng rãi và xử lý ngay tại hiện trường hoặc điểm chăm sóc mà không cần nhiều thiết bị hiện đại, ít tốn kém...
Phạm Thanh Tâm
(lược dịch theo New England Biolabs)